2.4. Чем различаются основные компоненты клетки — физическим состоянием или конформацией?
Три главных компонента протоплазмы и клетки — это вода, белки и ионы К+. Адсорбированное состояние К+ и воды в клетках уже установлено, и еще одно, термодинамическое обоснование этого утверждения, приведено выше. Но особого внимания со стороны теории требует конформация внутриклеточных белков. Пытаться обнаружить действительно нативную (как ее понимает ТАИ) конформацию белков в клетке в состоянии покоя — это вс е равно, что пытаться выяснить, жива или мертва кошка внутри черного ящика, если при каждом его открывании впрыскивать в него предварительно порцию сильнейшего яда, мгновенно убивающего животное. Это нужно понимать так, что мы никогда не сможем установить истинную конформацию белков внутри покоящейся клетки, если всякий раз будем измельчать ее, экстрагировать белок весьма нефизиологичными растворами и проходить все остальные жесткие этапы, которые обычно включает выделение так называемых нативных белков. Необходим неинвазивный подход, которого, естественно, нет и не предвидится.
2.4.1.Выяснение конформации гемоглобина по распределению ионов К+ и Na+ между эритроцитами и средой
Эритроциты, как и большинство клеток, избирательно накапливают К+ и частично вытесняют Na+. Гемоглобин составляет 97% внутриклеточных белков эритроцитов. Исходя из установленного адсорбированного состояния К+ и воды в клетках, мы вправе ожидать, что гемоглобин играет важную роль в адсорбции К+ и вытеснении Na+. Однако так называемый нативный гемоглобин, будучи растворенным в воде в той же концентрации, что и в нормальных эритроцитах (36%), адсорбирует лишь малую часть ионов К+ или Na+, либо вовсе их не связывает. Кроме того, вода в 36% растворе нативного гемоглобина не вытесняет Na+.
ТАИ утверждает, что гемоглобин в эритроцитах отличается по свойствам от выделенного «нативного» гемоглобина, так как имеет в покоящейся клетке совершенно иную конформацию. Это подтверждают две группы данных:
1. Действительно, обработка раствором NaOH в концентрации 0,4 М освобождает не только все β- и γ-карбоксильные группы, делая возможной стехиометрическую избирательную адсорбцию ими Na+ или К+, но и NHCO-группы полипептидного остова, позволяя им связывать, поляризовать и ориентировать окружающую воду, превращая ее в плохой растворитель для сахарозы и Na+. Как видно из этих опытов, гемоглобин способен адсорбировать К+ и снижать растворимость Na+ в воде, и он делает это тогда, когда возникают соответствующие условия. Каковы же эти условия? Заглянем для этого в живой эритроцит.
2. Если поместить свежие эритроциты в гипотонический раствор и подвергнуть их гемолизу, они утрачивают полностью или частично гемоглобин, ионы К+ и способность частично вытеснять Na+. Если к полученной таким образом взвеси теней эритроцитов добавить сахарозу, восстановив этим изотоничность среды, тени замкнутся, а их последующая инкубация при 37 °С вновь приведет к накоплению К+ и вытеснению Na+ — но это возможно лишь при условии, что в растворе до образования замкнутых теней будет присутствовать необходимое количество АТФ, а в самих тенях останется достаточное количество гемоглобина и некоторое количество прочно связанного, устойчивого к гемолизу вспомогательного белка X.
[В этой связи уместно будет привести цитат из диссертации Самохоцкого, глава 7: «Экспериментальной проверке надлежало дать ответ на следующие вопросы: вызывают ли данные вещества изменение биологических свойств крови, т.е. каково их влияние на свертываемость крови, гемолиз эритроцитов, оседание их и т.д. и...
Исследование этих моментов показало следующее: данные составы значительно задерживают процесс свертывания крови. Гемолиз эритроцитов почти отсутствует при разведении 1:1... Реакция оседания эритроцитов при смешении с этими составами была значительно замедлена».]
Согласно экспериментальным данным, равновесное содержание К+ в тенях, как и степень вытеснения Na+ из них, количественно связано с содержанием в них остаточного белка (в основном гемоглобина) — чем больше белка, тем больше ионов К+ в тенях, тем сильнее вытеснение Na+ из них. Замкнутые «белые» тени, полностью лишенные гемоглобина, не накапливают К+ и не вытесняют Na+. Более того, гемоглобин, необходимый для накопления в тенях К+ и вытеснения Na+, вовсе не обязан быть «родным» гемоглобином эритроцитов. Его можно заменить на чужеродный гемоглобин так, чтобы при закрытии теней после гемолиза он оказался внутри восстановленных клеток-теней.
В совокупности представленные данные показывают, что конформация гемоглобина в эритроцитах отличается от конформации выделенного нативного гемоглобина тем, что NHCO-группы его полипептидного остова, а также β- и γ-карбоксильные группы свободны от водородных и солевых связей и потому способны связывать воду и К+. Кроме того, ясно, что гемоглобин, присутствующий изначально или введенный извне в тело эритроцита, принимает эту конформацию под влиянием АТФ и ее помощников — белка X, а также конгруэнтных анионов (Сl-).
2.4.2 Определение конформационного состояния миозина в мышечных волокнах лягушки по распределению неэлектролитов между клеткой и средой.
Желатин, полиэтиленоксид (ПЭО), денатурированный NaOH гемоглобин, и другие экстравертные модели имеют в растворах полноразвернутую конформацию. Благодаря этому они способны связывать значительное количество воды и вытеснять неэлектролиты в объем, заполненный свободной водой, и этот эффект тем значительнее, чем больше размер молекул растворенного вещества. График зависимости величин q неэлектролитов от логарифма их молекулярной массы (или молекулярного объема) представляет собой S-образную кривую. В случае растворов нативных (глобулярных) белков величина q почти не меняется, оставаясь около значения, близкого к 1 при самых разных размерах молекул неэлектролитов (вплоть до молекулярного объема около 500 мл/моль). Подобно неэлектролитам в растворах экстравертных моделей — и в противоположность растворам «нативного» гемоглобина — график зависимости величин q, полученный для 21 неэлектролита в мышечных волокнах лягушки, от их молекулярного объема представляет собой S-образную кривую. На основании этого сравнения можно сделать однозначный вывод, что основные мышечные белки — миозин и актин — имеют в покоящемся мышечном волокне лягушки конформацию, близкую к полноразвернутой.
Этот вывод подкрепляется и другими чертами сходства свойств клеточной воды и воды в растворах экстравертных макромолекул, которыми, однако, не обладает вода растворов интровертных полимеров.
2.4.3.Выяснение конформации миозина и актина в мышечных волокнах лягушки по поглощению водяного пара
Мышца лягушки примерно на 80% состоит из воды, и на 20% — из белков. При таком соотношении 1 г белков мышечных волокон в среднем должен поглощать, согласно ТМОПВ, 4 г воды. При помощи нового метода нулевой точки, Линг и Ху изучили поглощение пара интровертными белками и экстравертными полимерами — желатином, полиэтиленоксидом (ПЭО), поливинилпирролидоном (ПВП) и поливинилметиловым эфиром (ПВМЭ), — в труднодостижимых условиях, когда относительное давление пара близко к насыщению.
Результаты показали, что лишь экстравертные модели (макромолекулы в полноразвернутой конформации) при этом (физиологическом) давлении пара могут поглощать почти столько же воды, сколько и мышцы лягушки. В то же время, все исследованные глобулярные белки поглощают лишь от ¼ до ½ того количества воды, которое могут поглощать мышечные волокна лягушки. Эти данные еще раз показывают, что если не весь миозин и актин, то хотя бы их большая часть должна находиться в полноразвернутом состоянии, которое одно только способно поглотить столько воды, сколько поглощается интактными мышечными волокнами.
Кстати, концентрация свободных веществ в клетке (таких, как Na+ и Сl-) слишком низка, чтобы значимо влиять на поглощение воды через механизм осмоса. Более распространенные в клетке вещества — такие, как К+, АТФ и креатинфосфат — адсорбированы и вследствие этого осмотически неактивны или почти неактивны.
Терапевтическая польза, которую мы извлекаем из п. 2.4 — становятся понятны:
- фундаментальная роль хромовых солей в растворах Самохоцкого в поддержании жизнеспособности умирающих клеток,
- роль растворов Самохоцкого в предотвращении гемолиза принципы терапии шоковых, травматических состояний.